周唯践1，何路2，鲁娅蓉2，和桂梅2，粟荣1，殷世云1，彭江云1*
(1.云南中医药大学第一附属医院，2.云南省中医医院2017级规培学员）
（本论文荣获“第七届兰茂论坛”优秀论文三等奖）
[摘要] 目的：通过网络药理学来研究加味桂枝附子汤治疗类风湿关节炎的活性成分、作用靶点及作用机制。方法：通过GeneCards数据库检索类风湿关节炎疾病相关基因，采用中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）检索桂枝、附子、白芍、羌活、独活、细辛化学成分、作用靶点基因，利用Cytoscape3.7.2构建成分与靶点网络，与类风湿关节炎疾病相关基因取交集并进行GO富集分析和KEEG通路分析，研究加味桂枝附子汤的作用机制。结果：共筛选出加味桂枝附子汤治疗类风湿关节炎活性成分62个，差异基因43个；GO富集分析主要富集于流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、TOII样受体信号通路等。结论：通过网络药理学分析，加味桂枝附子汤可能通过IL6、JUN、MAPK8、PTGS2靶基因对类风湿关节炎发挥治疗作用，是一种多层次、多通路、多因素相关联的结果。
[关键词] 加味桂枝附子汤；类风湿关节炎；网络药理学；
类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）属于中医学“痹证”、“尪痹”范畴。寒湿痹阻是RA常见临床证型[1]，温阳通络是治疗RA寒湿痹阻证的有效方法[2-4]。加味桂枝附子汤源于《金匮要略》173条：“伤寒八九日，风湿相搏，身体疼烦，不能自转侧，不呕不渴，脉浮虚而涩者，桂枝附子汤主之”，吴佩衡、吴生元等名老中医在此基础上重用附子，并加入养血散寒、通经活络之品增强温阳通络，散寒除湿之功，其组成为：桂枝、附子、白芍、细辛、羌活、独活、防风、海风藤、海桐皮、川芎、大枣、生姜、甘草，是云南吴佩衡扶阳学术流派治疗寒湿痹证常用方剂，临床广泛用于RA、骨关节炎、强直性脊柱炎、皮肌炎、肩周炎等，并取得满意疗效[5-7]。
本研究通过GeneCards数据库检索RA发病相关基因及TCMSP 网站（http://tcmspw.com/tcmsp.php）[8] 预测中药作用靶基因，为探索加味桂枝附子汤治疗RA的作用机制提供大数据集成的理论依据。
1. 资料与方法
1.1加味桂枝附子汤主要药物化学成分筛选及预测其作用靶点
通过中药系统药理学技术平台( TCMSP ) ，以桂枝、附子、白芍、细辛、羌活、独活6味中药检索其化学成分，对上述药物的化学成分进行筛选，以化合物的口服生物利用度（OB）≥30%，化合物的类药性（DL）≥0.18，将 TCMSP 中具有较高活性的化合物进行筛选提取，取6味中药共同作用的靶基因，通过 Cytoscape 3.7.2软件绘制药物-化合物-靶基因网络图。
1.2 疾病基因数据检索
以“rheumatoid arthritis”为关键词，在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）中检索获得信息，运用Excel进行数据筛选获取RA相关基因和靶蛋白信息。
1.3 筛选
将1.1及1.2步骤获得的靶基因取交集，通过Cytoscape 3.7.2软件cytoHubba插件进行“Top 10 nodes ranked by MCC”筛选得到加味桂枝附子汤治疗RA的潜在作用靶点网络。采用string db数据库进行蛋白相互作用网络分析。
1.4靶点生物学功能、通路及分析蛋白相互作用网络分析
采用R软件的org.Hs.eg.db、clusterProfiler包，以P<0.05为筛选条件，对差异基因行 GO富集分析及KEGG通路分析。
2.结果
2.1 通过GeneCards数据库检索下载数据，运用Excel进行数据筛选得到RA相关基因和靶蛋白信息3426条。
2.2 经过TCMSP平台预测分析，以OB≥30%，DL≥0.18为条件进行筛选，得到桂枝、附子、白芍、羌活、独活、细辛6味中药活性有效成分共62个候选化合物（含有7个共同成分），结果见表1。
| 表1 桂枝、附子、白芍、羌活、独活、细辛活性有效成分 | |||
| 分子编号 | 化合物名称 | OB (%) | DL |
| MOL000073 | ent-Epicatechin | 48.96 | 0.24 |
| MOL000211 | Mairin | 55.38 | 0.78 |
| MOL000358 | beta-sitosterol | 36.91 | 0.75 |
| MOL000359 | sitosterol | 36.91 | 0.75 |
| MOL000422 | kaempferol | 41.88 | 0.24 |
| MOL000492 | (+)-catechin | 54.83 | 0.24 |
| MOL000538 | hypaconitine | 31.39 | 0.26 |
| MOL001460 | Cryptopin | 78.74 | 0.72 |
| MOL001558 | sesamin | 56.55 | 0.83 |
| MOL001736 | (-)-taxifolin | 60.51 | 0.27 |
| MOL001910 | 11alpha,12alpha-epoxy-3beta-23-dihydroxy-30-norolean-20-en-28,12beta-olide | 64.77 | 0.38 |
| MOL001918 | paeoniflorgenone | 87.59 | 0.37 |
| MOL001919 | (3S,5R,8R,9R,10S,14S)-3,17-dihydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-2,3,5,6,7,9-hexahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene-15,16-dione | 43.56 | 0.53 |
| MOL001921 | Lactiflorin | 49.12 | 0.8 |
| MOL001924 | paeoniflorin | 53.87 | 0.79 |
| MOL001925 | paeoniflorin_qt | 68.18 | 0.4 |
| MOL001928 | albiflorin_qt | 66.64 | 0.33 |
| MOL001930 | benzoyl paeoniflorin | 31.27 | 0.75 |
| MOL001941 | Ammidin | 34.55 | 0.22 |
| MOL001942 | isoimperatorin | 45.46 | 0.23 |
| MOL001951 | Bergaptin | 41.73 | 0.42 |
| MOL001956 | Cnidilin | 32.69 | 0.28 |
| MOL002211 | 11,14-eicosadienoic acid | 39.99 | 0.2 |
| MOL002388 | Delphin_qt | 57.76 | 0.28 |
| MOL002392 | Deltoin | 46.69 | 0.37 |
| MOL002393 | Demethyldelavaine A | 34.52 | 0.18 |
| MOL002394 | Demethyldelavaine B | 34.52 | 0.18 |
| MOL002395 | Deoxyandrographolide | 56.3 | 0.31 |
| MOL002397 | karakoline | 51.73 | 0.73 |
| MOL002398 | Karanjin | 69.56 | 0.34 |
| MOL002401 | Neokadsuranic acid B | 43.1 | 0.85 |
| MOL002406 | 2,7-Dideacetyl-2,7-dibenzoyl-taxayunnanine F | 39.43 | 0.38 |
| MOL002410 | benzoylnapelline | 34.06 | 0.53 |
| MOL002415 | 6-Demethyldesoline | 51.87 | 0.66 |
| MOL002416 | deoxyaconitine | 30.96 | 0.24 |
| MOL002419 | (R)-Norcoclaurine | 82.54 | 0.21 |
| MOL002421 | ignavine | 84.08 | 0.25 |
| MOL002422 | isotalatizidine | 50.82 | 0.73 |
| MOL002423 | jesaconitine | 33.41 | 0.19 |
| MOL002433 | (3R,8S,9R,10R,13R,14S,17R)-3-hydroxy-4,4,9,13,14-pentamethyl-17-[(E,2R)-6-methyl-7-[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-[[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxyhept-5-en-2-yl]-1,2,3,7,8,10,12,15,16,17-decahydr | 41.52 | 0.22 |
| MOL002434 | Carnosifloside I_qt | 38.16 | 0.8 |
| MOL002501 | [(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-1-carboxylate | 62.52 | 0.31 |
| MOL002644 | Phellopterin | 40.19 | 0.28 |
| MOL002881 | Diosmetin | 31.14 | 0.27 |
| MOL002962 | (3S)-7-hydroxy-3-(2,3,4-trimethoxyphenyl)chroman-4-one | 48.23 | 0.33 |
| MOL003608 | O-Acetylcolumbianetin | 60.04 | 0.26 |
| MOL004576 | taxifolin | 57.84 | 0.27 |
| MOL004777 | Angelol D | 34.85 | 0.34 |
| MOL004778 | [(1R,2R)-2,3-dihydroxy-1-(7-methoxy-2-oxochromen-6-yl)-3-methylbutyl] (Z)-2-methylbut-2-enoate | 46.03 | 0.34 |
| MOL004780 | Angelicone | 30.99 | 0.19 |
| MOL004782 | [(1R,2R)-2,3-dihydroxy-1-(7-methoxy-2-oxochromen-6-yl)-3-methylbutyl] 3-methylbutanoate | 45.19 | 0.34 |
| MOL004792 | nodakenin | 57.12 | 0.69 |
| MOL009849 | ZINC05223929 | 31.57 | 0.83 |
| MOL011169 | Peroxyergosterol | 44.39 | 0.82 |
| MOL011962 | 6'-Feruloylnodakenin | 32.02 | 0.67 |
| MOL011963 | 8-geranoxy-5-methoxypsoralen | 40.97 | 0.5 |
| MOL011968 | coumarin,glycoside | 33.07 | 0.78 |
| MOL011969 | Demethylfuropinnarin | 41.31 | 0.21 |
| MOL011971 | diversoside_qt | 67.57 | 0.31 |
| MOL011975 | notoptol | 62.97 | 0.48 |
| MOL012140 | 4,9-dimethoxy-1-vinyl-$b-carboline | 65.3 | 0.19 |
| MOL012141 | Caribine | 37.06 | 0.83 |
2.3 通过Cytoscape 3.7.2软件将化合物和作用靶点相连，绘制出上述六味中药的“药物-化合物-靶基因” 相互作用网络图（图2），直观地反映这些药物、化合物与靶基因的相互作用。
图1“药物-化合物-靶基因”相互作用网络图，绿色代表药物，红色代表有效化学成分，紫色代表靶基因。
2.4 桂枝、附子、白芍、羌活、独活、细辛六味中药预测到的62个有效化学成分的潜在作用靶点有74个，与 2.1 结果交叉（图2），得到共同靶基因43个（表 2）。
图2 中药作用靶基因与类风湿关节炎Venn图
表2 中药作用靶基因与RA相关基因交集表
| 表2 中药作用靶基因与RA相关基因交集表 | |
| 作用靶点基因名称 | |
| 桂枝、附子、白芍、羌活、独活、细辛药物成分作用靶基因与RA交集 | NOS2、BCL2、HTR3A、GSTP1、AHR、ECE1、PTGS2、ESR1、CCNA2、GSK3B、MMP1、NR3C2、HMOX1、GSTM1、G6PD、MAPK8、AKR1B1、PGR、CAT、CHRM3、ESR2、SLC6A4、ALOX5、PON1、TNFSF15、PPARG、SELE、NR3C1、MAPK14、ADRB2、ACHE、IL6、KDR、CYP1A2、OPRD1、CHRM2、OPRM1、VCAM1、INSR、PTGS1、JUN、AR、CYP3A4 |
2.5 将2.4获得作用靶点基因采用string db数据库进行蛋白相互作用网络分析，并通过Cytoscape 3.7.2软件cytoHubba插件进行“Top 10 nodes ranked by MCC”筛选得到加味桂枝附子汤治疗RA的潜在作用靶点网络（图3）。
图3加味桂枝附子汤治疗RA的潜在作用靶点网络
2.6 对差异基因行GO富集分析，显示其BP主要富集于脂多糖调控、氧化应激反应、丝氨酸肽磷酸化、环化酶活性调控的信号通路等，MF富集于血红素结合、辅因子结合、类固醇激素受体活性、RNA聚合酶II转录因子结合等。CC显示主要定位于细胞膜、触突前膜受体、受体复合物、内质膜等（图4）。 KEGG分析显示主要富集于流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、TOII样受体信号通路、破骨细胞分化信号通路、类风湿关节炎等信号通路（图5）。
图4 GO富集分析
图5 KEGG信号通路分析
3.讨论
类风湿关节炎是一种的全身性自身免疫性疾病，以多关节的慢性侵蚀性滑膜炎为主要临床表现，其发病的确切病因尚不明确，与遗传、环境、内分泌、感染和免疫等多种因素相关。类风湿关节炎主要侵犯手足小关节，除关节外，肺、心神经系统等其他器官或组织亦可受累。主要病理变化为关节滑膜细胞浸润，滑膜翳形成，软骨及骨组织的侵蚀。滑膜反应炎症，最终导致关节结构破坏，畸形和功能丧失[9]。目前类风湿关节炎治疗多以非甾类抗炎药（NSAID）、糖皮质激素、改变病情抗风湿药（DMARD）为主，虽然近年来不少生物制剂及小分子靶向药物面市，但因价格昂贵仍不能在临床广泛应用，从中医药资源中寻找挖掘针对类风湿关节炎的潜在治疗成分越来越受到重视。
加味桂枝附子汤是吴生元教授在《金匮要略》原方基础上创用的，方中桂枝温经散寒、调和营卫；附子温阳祛湿、通络止痛；白芍敛阴和营，缓急止痛；羌活、独活祛风通络；细辛温经散寒通络；诸药合用具有通达表里、温经散寒、通络止痛之功。本研究以网络药理学为基础，通过构建“药物-成分-靶基因-疾病”网络，对加味桂枝附子汤中6个重要中药的化学成分进行分析，得到的中药有效成分可能与类风湿关节炎相关的43个靶基因，其中IL6、JUN、MAPK8、PTGS2靶基因与RA炎症反应有密切联系[10-15]，作用于TNF信号通路、IL-17信号通路、TOII样受体信号通路等经典炎症通路，提示加味桂枝附子汤是通过多靶点、多途径发挥治疗作用，是一种多层次、多通路、多因素相关联的结果。
综上所述，本研究采用网络药理学方法对名老中医临床验方分析，研究加味桂枝附子汤有效活性成分治疗类风湿关节炎的作用机制，为进一步从加味桂枝附子汤中提取有效活性成分治疗类风湿关节炎提供了理论依据，也为临床总结名老中医经验提供新思路。但是，与其他网络药理学分析研究一样，研究存在局限性，未对处方煎剂成分进行质谱分析，另外本研究的获得的靶点基因和它相关的信号通路没有通过体外研究或其他功能研究得到证实。因此，需要进一步通过实验检测来验证。
参考文献
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