王一帆1， 朱学启1,邓颖1，杨磊1 ，谭云鹏1，袁青云1，高红瑞1
（1.云南省文山州中医医院骨伤一科, 云南 文山 663099）
摘要：目的 基于“平衡理论”从调节骨质疏松大鼠模型骨代谢及骨转化率平衡方面探讨补肾益骨方抗骨质疏松的作用机制。方法 选取8月龄SPF级SD大鼠 60 只随机分为空白组，模型组，阳性对照组，高、中、低剂量治疗组（n=10），所有大鼠均通过去双侧卵巢手术造模。造模后 2 周开始给予药物灌胃干预。阳性对照组予阿伦磷酸钠灌胃，模型组予生理盐水等量灌胃，高、中、低剂量治疗组分别根据分组不同给予不同剂量补肾益骨方药液灌胃。药物干预持续 12 周后取大鼠股骨中段骨质HE检测股骨病理改变，采集大鼠静脉血液检测血清中血 Ca、P 浓度，ELISA 法检测PINP、PICP、CTX、NTX表达水平。结果 HE染色检查显示模型组骨组织呈明显骨质疏松改变。药物干预后大鼠骨质疏松病理改变明显改善；模型组大鼠血磷、血钙浓度低于空白组（P<0.05），药物干预后血磷、血钙浓度有所上升但无统计学差异（P>0.05）；模型组大鼠PINP、PICP、CTX、NTX浓度较空白组均明显升高（P<0.05），对照组及低、中、高剂量组大鼠PINP、PICP、CTX、NTX浓度较模型组降低（P<0.05）；低、中、高剂量组大鼠PINP、PICP、CTX、NTX浓度较阳性对照组有不同程度的降低（P<0.05），中剂量组大鼠PICP、CTX、NTX浓度与空白组比较无统计学差异（P>0.05）。结论 补肾益骨方能改善去卵巢OP大鼠模型骨质，机制与调节OP大鼠钙、磷代谢，遏制OP大鼠骨代谢亢盛，降低骨转化率，恢复机体“阴阳”平衡状态有关，且不同剂量“补肾益骨方”无明确的用药剂量依赖趋势，以中等剂量调节骨代谢效果明显。
关键词 补肾益骨方、骨质疏松、骨代谢、PINP、PICP、CTX、NTX
The Study of Mechanism of Bushen Yigu Recipe on Regulating Bone Metabolism to Treat Osteoporosis Based on "Balance" Theory
Wang Yifan1， Zhu Xueqi1*,Deng Yin1，Yang Lei1 ，Tan Yunpeng1，Yuan Qingyun1，Gao Hongrui1
（1.Department of Orthopaedics and Traumatology，Wenshan traditional Chinese medicine hospital，Yunnan 663099，China）
Abstract: Objective Based on the balance theory, to explore the mechanism of Bushen Yigu recipe regulat the balance of bone metabolism and conversion rate on treatment of osteoporosis rat model.Method The study had selected 60 SPF SD rats（8-month-old） and had randomly divided into blank group, model group, control group and high, medium and low dosage treatment groups（n=10）.The rats were treated bilateral ovariectomy to establish OP modle.The rats were intragastric perfused drug 2 weeks after modeling:Rats of control group were perfused with alendronate sodium，rats of model group were perfused with normal saline，and rats of high, medium and low dosage treatment groups were perfused with different dosage of Bushen Yigu recipe.After 12 week of treatment,The femur of rats had been surgically removed and tested by HE.The venous blood of rats was collected to test the concentration of serum Ca and P,tast the levels of PINP, PICP, CTX and NTX by ELISA.Result The result of HE test had showed that the bone tissue of the model group had obvious changed with osteoporosis and the chang had been relieved after treatment .The concentration of serum Ca and P of model group was lower than blank group（P<0.05） and the concentration have been improved after treatment（P>0.05）.The concentrations of PINP, PICP, CTX and NTX in the model group were higher rised than the blank group (P < 0.05).the concentrations in the control group ,the high, medium and low dosage treatment groups were reduced than the model group after treatment(P < 0.05).The concentrations in low, medium and high dosage groups were lower than those in control group(P < 0.05).The concentrations in the medium dosage group were not different compared with the blank group (P > 0.05).Conclusion Bushen Yigu recipe can improve the bone quality of osteoporosis rats had been treated bilateral ovariectomy.The mechanism of treating osteoporosis is regulating calcium and phosphorus metabolism in OP rats, curbing hyperactivity of bone metabolism, reducing bone conversion rate and restoring the balance of "Yin and Yang".There are not clearly dosage-dependent trend on different dosage group，but the effect of medium dosage might be the best choice with regulating bone metabolism。
Keywords Bushen Yigu recipe, osteoporosis, bone metabolism, PINP, PICP, CTX, NTX
课题基金 云南省科技厅—云南中医药大学应用基础研究联合专项（2019FF002（-077）），云南省文山州中医院科研项目（WZKY立项字[2020]-07）,文山州“七乡名医”培养计划项目（文卫健发[2019]17号）。
作者简介:王一帆（1990-12），男，硕士学历，主治医师，中西医结合治疗骨关节疾病，E-mail:wangyifan1203@163.com
通信作者:朱学启（1977-11），男，本科学历，副主任医师，脊柱和关节疾病临床诊疗，E-mail:15394999520@163.com
前言
骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是高骨转化率性骨代谢失常，致骨量减少，骨质降低引起骨折高发、全身性疼痛等症的一种代谢性疾病，病因繁多，患病率高[1]。中国成年人OP患病率约为7%，预测2050年中国OP患者可高达5.33亿。本病是中老年人特别是绝经后妇女的常见病、多发病，超过半数50岁以上女性受到OP困扰[2]，患者常并发脊柱、股骨、肱骨近端脆性骨折而最终致残、致畸甚至致死。严重危害人类的生活质量并造成巨大经济损失。现代医学治疗主要以补充矿化类制剂、骨吸收抑制药物、骨形成促进药物等方法，长期口服此类药物均有不同程度的副作用[3,4]，中医药治疗具有作用缓慢持久、整体调节、不良反应小及无明显药物依赖等特点，乃当下较有潜力的治疗方法。课题组前期研究发现补肾益骨方能够有效改善患者骨密度及全身骨关节疼痛等症状，此研究从调节OP大鼠模型骨代谢平衡方面探讨补肾益骨方抗骨质疏松的作用机制。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物
选取8月龄SPF级SD大鼠60只，体重200g±20g，在室温18-22℃，湿度28%环境中适应性饲养1周后使用。
1.1.2实验药物及试剂
阳性对照药：阿伦磷酸钠（石药集团欧意药业有限公司，批准文号：国药准字H10980109）；补肾益骨方（盐补骨脂15g、骨碎补30g、盐巴戟天15g、熟地20g、牛膝15g、菟丝子12g、黄芪25g、砂仁10g、红花6g、赤芍15g、炙甘草9g。浸泡30min后大火煮开，文火煮25分钟，倒出头煎药液，再次加水大火煮开，文火煮25分钟，取二次药液混合）。
1.1.3实验仪器
超净工作台，高速冷冻离心机，台式高速离心机，-80℃冰箱，高压灭菌锅，手术操作器械，3%戊巴比妥那，青霉素，骨密度检测仪，PINP、PICP、CTX、
NTX用ELISA试剂盒，酶标仪，洗板机，恒温培养箱及相关分析软件等。
1.2方法
1.2.1分组与造模方法
所有大鼠经称重记录后通过随机数字表法分为6个组（空白组，模型组，阳性对照组，高、中、低剂量治疗组）。参考文献[5]除空白组外，所有大鼠均通过去双侧卵巢手术造模。具体步骤：术前12h禁食，腹腔注射3%戊巴比妥那（30mg/kg）麻醉后切除双侧卵巢（空白组切除卵巢周围脂肪组织），术后青霉素连续注射4天预防感染。术后大鼠分笼饲养，自由饮水、进食、活动，动物房室温25±2℃，相对湿度60±5%，每日照明12h。
1.2.2干预措施
（1）大鼠给药剂量
大鼠每日灌胃量根据动物体表等效剂量换算法计算，参考人和动物体表面积折算的等效剂量比率表[6],每只动物每Kg体重给药量按临床人的等效量为中剂量,0.5倍等效量为小剂量,2倍等效量为大剂量。
（2）分组干预措施
从造模后2周开始即给予药物灌胃干预。每天灌胃一次，灌胃所用药液均为间接加热法加热摇匀，温服。药物干预持续12周，阳性对照组根据药物给予阿伦磷酸钠灌胃，模型组予生理盐水等量灌胃。高、中、低剂量治疗组分别根据分组不同给予不同剂量补肾益骨方药液灌胃。
1.2.3检测指标
分别于干预12周后采集大鼠新鲜静脉血液，取血完成后取大鼠股骨组织行HE检查。血液标本离心后提取血清并检测血清中血Ca、P浓度，ELISA法检测I型前胶原N端前肽（PINP）、Ｉ型前胶原羧基端前肽（PICP）、Ｉ型胶原C端肽（CTX）、Ｉ型胶原N末端肽（NTX）的蛋白表达水平。
1.3统计学方法
运用SPSS21.0进行统计学分析，所有计量资料数据以均数±标准差（`x±s）表示。所有数据进行正态分布检验及组间方差齐性检验，多组间比较使用One-wayANOVA分析，两两比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
1HE结果显示股骨病理改变：空白组：骨皮质较厚，骨小梁呈网状排列，结构完整，骨陷窝内骨细胞形态大小正常。模型组：骨小梁稀疏，变细，断裂且排列紊乱，可见大量空骨陷窝，骨小梁间隙增宽，骨细胞萎缩变小。阳性组及各给药组可见骨小梁较模型组增粗且间隙变小，排列相对规律，骨细胞与骨陷窝见腔隙也明显减小，骨细胞疏松萎缩可见明显改善。其中以中剂量较其他组显著。
注：A:空白组；B：模型组；C：对照组；D：低剂量组；E：中剂量组；F：高剂量组
2 补肾益骨方对OP大鼠血磷、血钙浓度影响
模型组大鼠血磷、血钙浓度低于空白组，差异有统计学意义（P<0.05）；各治疗组和空白组间血钙、血磷浓度差异无统计学意义（P>0.05）；各治疗组间血钙、血磷浓度差异无统计学意义（P>0.05）。（见表1）
表1 补肾益骨方对OP大鼠血磷、血钙浓度影响（x±s）
注：#：同空白组比较P<0.05,&：同模型组比较P<0.05，*：同对照组比较P<0.05。
3补肾益骨方对OP大鼠PINP、PICP、CTX、NTX蛋白浓度影响
模型组大鼠PINP、PICP、CTX、NTX浓度较空白组均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；对照组及低、中、高剂量组大鼠PINP、PICP、CTX、NTX浓度较模型组降低，差异有统计学意义（P<0.05）；同对照组比较，低、中、高剂量组大鼠PINP、PICP、CTX、NTX浓度有不同程度的降低，差异有统计学意义（P<0.05），中剂量组大鼠PICP、CTX、NTX浓度与空白组比较无统计学差异（P>0.05）。见表2，图1-4。
表2 补肾益骨方对OP大鼠PINP、PICP、CTX、NTX蛋白浓度影响（x±s）
注：#：同空白组比较P<0.05,&：同模型组比较P<0.05，*：同对照组比较P<0.05。
讨论
OP是骨科一种以骨量减少，骨质受损、骨强度降低，致骨脆性增加而易并发脆性骨折为特征的全身性代谢性骨病[7]，国内OP高发，预计2050年中国OP患者可高达5.33亿。绝经后女性的发病率为50.1%[8]，因其高发病、高致残及短期致死率严重危害老年人的健康，并逐步发展为全国性的重大疾病。目前认为OP是多因素综合作用导致的骨重建呈负平衡后所致。因此如何调节骨代谢，维持“成骨—破骨”平衡成为了抗OP治疗的关键。研究运用我院长期临床使用的验方“补肾益骨方”干预OP大鼠模型，从钙磷代谢、大鼠成骨、破骨代谢活性等方面探讨其作用机制。
研究发现通过补肾益骨方干预去卵巢OP大鼠模型，经HE染色观察可见大鼠股骨骨小梁较模型组增粗且间隙变小，排列相对规律，骨细胞与骨陷窝见腔隙也明显减小，骨细胞疏松萎缩可见明显改善。说明补肾益骨方可以有效改善OP大鼠的骨质。从钙磷代谢方面研究发现，模型组血钙、血鳞水平降低，而PINP、PICP等成骨代谢指标升高，考虑OP大鼠存在骨代谢活跃，钙、磷吸收障碍或因成骨代谢消耗血液中钙、磷成分导致，经过药物干预后，虽各治疗组血钙、血鳞水平同空白组及模型组之间无统计学差异（P>0.05），但比较均值等指标提示各药物干预组较模型组有所降低，提示调节钙磷代谢可能是补肾益骨方抗OP的机制之一。
I型胶原是骨矿化环节中唯一的胶原类型，是骨基质的主要构成。成骨细胞含大量I型前胶原，骨形成时I型前胶原被大量分泌至胞外，裂解成PICP、PINP和I型胶原三个片段，因此PICP、PINP可提示成骨的活跃程度。被作为抗骨质疏松症治疗效果的生化指标[9，10]。2011年国际骨质疏松基金会、国际临床化学和实验室医学联合会、2012年国际骨健康联盟均推荐血清PINP作为骨形成参考指标[11]。I型胶原交联羧基末端肽（CTX）、I型胶原交联氨基末端肽（NTX）是I型胶原骨代谢过程的降解产物，骨代谢过程中破骨细胞活跃，骨吸收速率增快的时候会有大量的CTX、NTX生成并排入血中[12]。是反应骨吸收的特异性指标[13]。国际骨质疏松基金会、国际临床化学和实验医学联合会推荐通过测定血清中CTX的水平来监测骨吸收情况。是良好的骨代谢检测指标,并在2012年国际骨健康联盟也推荐血清CTX作为骨吸收的参考指标之一[14]。本研究发现模型组PICP、PINP、CTX、NTX均明显升高，对照组及低、中、高剂量组大鼠PINP、PICP、CTX、NTX浓度较模型组降低，同阳性对照组比较，低、中、高剂量组大鼠PINP、PICP、CTX、NTX浓度有不同程度的降低，差异有统计学意义（P<0.05），中剂量组大鼠PICP、CTX、NTX浓度与空白组比较无统计学差异，提示大鼠经去卵巢造模后，呈骨代谢旺盛，成骨细胞及破骨细胞代谢活跃，经药物干预后，过于活跃的骨代谢活动能够纠正，且不同剂量组间比较，发现疗效吴明确剂量增加依赖，中剂量组能够调整骨代谢致正常水平。
从传统祖国医学理论讨论上述机制，认为万事万物均应该趋于平衡状态，如阴阳平衡才是一个正常的生理状态，当平衡被打破出现偏颇，机体则呈病理状态。以中医理论中“取类比象”的方法，可将骨代谢过程中成骨过程视为正面的状态，属阳；破骨过程为负面状态，属阴。则将骨代谢视为一个“成骨—破骨”的阴阳平衡。OP就是因为各种因素导致上述平衡打破，呈负平衡状态过盛而引发的疾病。随着人体的生、长、壮、老、已，人体阳气逐渐损耗，反应在骨代谢过程中即属阳的“成骨”代谢的逐渐减弱，与之相对抗属阴的“破骨”代谢相对的呈现出增强趋势，故逐渐出现骨代谢失衡，随着病程的进展，属阴的“破骨”代谢过于增强，机体为纠正这种阴阳属性的偏颇，属阳的“成骨”代谢必然随之亢盛，这种亢盛属于“虚亢”的病理形式。上述过程反应在本研究结果中就体现为OP大鼠模型出现反应成骨代谢及破骨代谢的PINP、PICP、CTX、NTX浓度较空白组均明显升高,呈现出阴盛而阳虚亢的表现，而经过“补肾益骨方”干预后OP大鼠首先反应破骨代谢水平的CTX、NTX蛋白浓度较模型组明显下降，同时反应成骨代谢活跃的PICP、PINP蛋白浓度亦随之下降，说明经过经过“补肾益骨方”干预后OP大鼠破骨代谢减缓，成骨代谢“虚亢”的阴阳失衡得以纠正。同时上述指标的改变也提示了OP大鼠的高骨转化率得到的明显的遏制。说明补肾益骨方能够有效调节OP大鼠骨代谢，抑制骨质高转化达到抗骨质疏松的目的。
从“补肾益骨方”组方思路讨论其作用机制。“补肾益骨方”由补骨脂、骨碎补、巴戟天、熟地、牛膝、菟丝子、黄芪、砂仁、红花、赤芍等药物组成。课题组认为肾虚为OP的基础病机，拟方中部分选用左归丸拟方思路，“善补阴者，必于阳中求阴，则阴得阳升而泉源不竭”，为“阴中求阳”以阴阳双补的代表方[15,16]，同时认为OP发病与脾虚密切相关，将之归“骨痿”范畴。“脾为后天之本，气血生化之源”“谷入气满，淖泽注于骨”。后天亏虚，则精亏髓空，而百骸痿废[17]，方中使用了黄芪等补脾益气的药物,后天脾胃强生方有精气养骨；中医学“血瘀”学说在OP发病机制中起着至关重要的作用。“旧血不去新血不生”，瘀血阻滞，本身即无滋养骨骼作用，同时阻滞体内，严重影响骨骼的局部微循环，以致骨组织新血化生缓慢，成骨功能受限[18]，方中加入赤芍、红花等活血化瘀之药，能够“祛瘀生新”，使旧血得去，新血以生，故筋骨得以濡养。另外从现代药理学研究显示左归丸有“类激素”作用，能够调节雌激素水平，降低骨转化率及骨丢失量，且副作用相对雌激素更小[19]。单味中药抗OP的研究报道显示补肾健脾活血的中草药能够有效抗OP。如骨碎补总黄酮抗绝经后骨质疏松症疗效显著且能有效缓解骨痛的临床症状[20]；补骨脂有效成分异补骨脂素能显著促进BMSCs向成骨细胞分化防治OP[21,22]。黄芪水提液含有多种多糖及皂甙类成分能提高股骨BMD和降低骨组织氧化应激水平，抑制氧化应激抗OP[23,24]，同时也有学者基于“去瘀生新”基础理论，在抗骨质疏松药物中采用赤芍，红花等活血药物，能够改善局部微循环瘀滞，促进成骨细胞活性及代谢，增加骨量，调节内分泌系统功能紊乱，增强抗OP作用[25,26]。
综上，补肾益骨方能有效改善去卵巢OP大鼠模型骨质，其机制与调节OP大鼠钙、磷代谢，遏制OP大鼠成骨及破骨代谢亢盛，降低骨转化率，恢复机体“阴阳”平衡状态有关，且不同剂量“补肾益骨方”无明确的用药剂量增加依赖趋势，以中等剂量调节骨代谢效果明显。
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