郭爽1，李蓉1，范源1,2*
（1.云南中医药大学中药学院，云南昆明650500；2.云南中医药大学第二附属医院，云南昆明，650216）
摘要：目的：基于网络药理学及分子对接对三果汤治疗糖尿病靶点及通路进行分析，并通过分子对接进行验证，为基础研究及临床用药提供科学依据。方法：通过中药系统药理学数据库与分子平台（TCMSP）、有机小分子生物活性数据库（PubChem）及文献查阅筛选三果汤中诃子、毛诃子、余甘子的活性成分及作用靶点，使用Genecard数据库、DRUGBANK数据库筛选糖尿病相关靶点，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络，取药物疾病靶点交集，使用STRING构建蛋白PPI网络，运用Matescape数据库对交集靶点基因进行GO、KEGG富集分析。将筛选出的有效成分与靶点进行分子对接验证。结果:通过网络药理学收集三果汤及糖尿病靶点信息，采用GO富集分析和KEGG通路分析发现，三果汤和糖尿病共同作用靶点共269个，靶点作用最为突出的为AKT1、HAS2、MAP2、CDH1、PRKCG、PLAT，三果汤作用于糖尿病的通路主要在癌症通路、脂质和动脉粥样硬化、MAPK信号通路。分子对接结果显示，鞣花酸和没食子酸对AKT1、HAS2、MAP2存在亲和力，鞣花酸对HAS2亲和力最好。结论：通过本研究中网络药理学分析及分子对接分析，三果汤中鞣花酸、没食子酸对AKT1、HAS2、MAP2通路靶点具有亲和力，为后续实验提供研究思路。
关键词：网络药理学；三果汤；糖尿病；分子对接
Abstract: Objective: To analyze the targets and pathways of Triphala in the treatment of diabetes based on network pharmacology and molecular docking, and to verify the mechanism of Triphala on diabetes through animal experiments, so as to provide a scientific basis for basic research and clinical medication. Methods: The active components and targets of myrobalan, myrobalan and emblica in Triphala were screened through the Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Molecular Platform (TCMSP), the organic small molecule biological activity database (PubChem) and literature review. Genecard database and DRUGBANK database screen diabetes-related targets, build a "drug-component-target-disease" network, take the intersection of drug and disease targets, use STRING to build a protein PPI network, and use Matescape database to conduct GO, KEGG enrichment analysis. Molecular docking verification is carried out between the screened active ingredients and the target. Results: The information of Triphala and diabetes targets was collected through network pharmacology, and GO enrichment analysis and KEGG pathway analysis were used to find that there were 269 common targets of Triphala and diabetes, and the most prominent targets were AKT1 and HAS2. , MAP2, CDH1, PRKCG, PLAT, the pathways that Triphala acts on diabetes are mainly in cancer pathway, lipid and atherosclerosis, and MAPK signaling pathway. Molecular docking results showed that ellagic acid and gallic acid had affinity for AKT1, HAS2 and MAP2, and ellagic acid had the best affinity for HAS2. The protein results showed that after treatment with Triphala, the protein expression level of AKT1 gene in the administration group increased. Conclusion: Through network pharmacology analysis and molecular docking analysis in this study, ellagic acid and gallic acid in Triphala have affinity for AKT1, HAS2, MAP2 pathway targets, which provides research ideas for subsequent experiments.
Key words: Network Pharmacology; Triphala; Diabetes; Molecular Docking
前言
糖尿病（Diabetic mellitus,DM）是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起的。长期高血糖会导致其他组织，包括眼、肾、心脏、血管的慢性损害、功能障碍等。在传统藏医学中，糖尿病被认为是“京尼萨库”病范畴，藏医理论认为“京尼萨库”主要是由于饮食起居不当等因素导致“三因”失衡引起。
藏药三果汤，由诃子、毛诃子、余甘子三味药构成，相关研究表明，其能降低空腹血糖水平[[[] Rajan SS, Antony S. Hypoglycemic effect of triphala on selected non insulin dependent Diabetes mellitus subjects. Anc Sci Life. 2008 Jan;27(3):45-9. ]]，并能抑制α葡萄糖苷酶和α淀粉酶活性[[[] Kamali SH, Khalaj AR, Hasani-Ranjbar S, Esfehani MM, Kamalinejad M, Soheil O, Kamali SA. Efficacy of 'Itrifal Saghir', a combination of three medicinal plants in the treatment of obesity; A randomized controlled trial. Daru. 2012 Sep 10;20(1):33. ]]，还可通过增强incretin/cAMP信号通路活性，影响胰岛β细胞增殖和凋亡[[[] 张艳娇. 藏药三果汤通过胰岛旁分泌调节β细胞功能的实验研究[D].云南中医药大学,2021.]]。在糖尿病并发症的治疗中，三果汤通过抑制TGF-β1和氧化应激，改善糖尿病肾病症状[[[] Suryavanshi SV, Garud MS, Barve K, Addepalli V, Utpat SV, Kulkarni YA. Triphala Ameliorates Nephropathy via Inhibition of TGF-β1 and Oxidative Stress in Diabetic Rats. Pharmacology. 2020;105(11-12):681-691. ]]；改善TGF-β1、TNF-α、IL-1β，降低糖尿病神经病变进展。经富集分析可知，癌症通路为三果汤主要通路之一，Ali Sahragard团队研究发现，三果汤提取物可抑制人肝癌细胞增殖，降低其存活率[[[] Sahragard A, Alavi Z, Abolhassanzadeh Z, Moein M, Mohammadi-Bardbori A, Omidi M, Zarshenas MM. Assessment of the Cytotoxic Activity of Triphala: A Semisolid Traditional Formulation on HepG Cancer Cell Line. Biomed Res Int. 2021 Aug 11;2021:6689568. ]]。
网络药理学，是基于系统生物学的理论，对生物系统的网络分析，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的一门学科，并强调对信号通路的多途径调节，提高药物的治疗效果，降低毒副作用，提高新药临床试验成功率的有力手段。最早由我国学者李梢提出“网络靶标”，并制定首个标准《网络药理学评价方法指南》，为网络药理学这一新兴学科奠定了基础[[[] 李梢.网络靶标:中药方剂网络药理学研究的一个切入点[J].中国中药杂志,2011,36(15):2017-2020.],[[] 首个《网络药理学评价方法指南》发布[J].中医杂志,2021,62(09):776.]]。网络药理学能够通过对中药复方作用靶点及信号通路的分析，预测潜在的药理作用及信号通路，对中药复方的基础研究及临床应用提供了新思路[[[] 陈健,陈启龙.网络药理学在中医药研究中的现状及思考[J].上海中医药大学学报，2021,35(05):1-6+13.]]。本研究就藏药三果汤治疗糖尿病作用机制进行网络药理学分析及分子对接验证进行初步探讨，为后续实验提供思路。
1. 实验方法
1.1 网络药理学
1.1.1 三果汤的活性成分及作用靶点
采用TCMSP数据库（http: / /lsp.nwu.edu.cn /tcmsp.php)，分别检索三果汤中诃子、余甘子、毛诃子有效成分，并根据药物口服生物利用度（Oral Bioavailability,OB）≥30%、类药性（Drug Likeness,DL）≥0.18进行初步筛选，由于TCMSP中检索毛诃子结果为无，则结合前期研究及文献，以及在PubChem数据库(http: / /pubchem. ncbi. nlm. nih. gov)检索结果整合毛诃子中化合物。使用UniPort数据库( http: / /www.uniprot.org /uniprot /)将化合物靶点蛋白名称转换为基因名，删去重复项，即得三果汤潜在作用靶点。
1.1.2 糖尿病相关靶点筛选
以Diabetic为关键词在Genecard数据库（https://www.genecards.org）、DRUGBANK数据库（https://www.drugbank.ca/）进行检索，结合文献查阅结果，进行结果整合，删除重复项，使用UniPort数据库( http: / /www.uniprot.org /uniprot /)将靶点名转换为基因名。
1.1.3 构建药物靶点疾病靶点PPI网络及富集分析
蛋白质相互作用网络（PPI）是指蛋白通过彼此之间的相互作用构成，来参与生物信息传递、基因表达调节、能量和物质代谢及细胞周期调控等生命过程的各个环节，系统的分析了蛋白在生物系统中的相互作用关系。
使用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）在线制作疾病靶点、药物靶点的VENN图，导出三果汤和糖尿病的共同靶点。使用STRING（https://string-db.org/）数据库，将物种选为Homo Sapiens，设置靶点关联置信度为0.900，隐藏无蛋白相互作用靶点，获得PPI网络图。使用Cytoscape v3.9.1构建“药物-成分-靶点-疾病”关系网络。
采用Matescape数据库（https: / /metascape.org /）进行GO富集分析和KEGG通路分析，物种选择“H specises”，选择“Custom Analysis”，分别进行KEGG通路分析和GO富集分析。 其中，GO富集分析包括细胞组分（CC）分析、分子功能（MF）分析和生物过程（BP）分析，通过富集分析可以看到目标基因在三个层面上的关联。筛选四次分析的数据前20个通路，绘制出富集条形图和气泡图。
1.2 分子对接
使用PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载蛋白靶点对应的晶体结构，在TCMSP中下载药物有效成分的3D结构的mol.2格式。使用AUTODock Tools去加氢，计算电荷等，为分子对接提供基础数据。使用AUTODock 进行分子对接，对接的结果通过Openbabel(Ver3.1.1)将其转换为pdb格式，用pymol2.6.0进行图像处理。
2.实验结果
2.1三果汤中活性成分筛选
通过TCMSP筛选及文献检索补充，可得三果汤中有效活性成分共49种，主要为萜类、黄酮类、多元酚类成分，活性靶点以没食子酸、诃子酸、诃子次酸、鞣花酸、槲皮素等为主。
表2 活性成分Mol ID、活性成分名称及分子式
2.2药物靶点、疾病靶点韦恩（VENN）分析
根据TCMSP、Genecard、DRUGBANK数据库及文献筛选出三果汤有效成分对应靶点基因和糖尿病作用靶点，可知，三果汤有效靶点共283个，糖尿病疾病靶点共16660个，在UniPort数据库中将靶点名称转化为基因名，将有效成分对应的基因名进行标准化，经筛选得出具有作用靶点基因的有效化学成分35个。使用微生信网站绘制VEEN图（图1），由图可知，三果汤与糖尿病作用靶点基因有269个共同靶点。
根据VENN分析结果，由于有效成分名称复杂，故作图时，给予标号S1-S35命名（如表3）。使用Cytoscape 3.9.1绘制药物-成分-靶点-疾病网络关系图（图2）。
图1 三果汤药物作用靶点与糖尿病疾病靶点的VENN图
表3 化学成分代码对照表
图2 药物-成分-靶点-疾病网络图
2.3三果汤治疗糖尿病蛋白相互作用网络分析
使用STRING数据库对三果汤治疗糖尿病蛋白之间相互作用的网络图构建（图2），隐藏无蛋白相互作用靶点后，如图所示，可见PPI网络中包含结点274个，接点之间包括1238个蛋白作用关系以及464个预期作用关系。图中接点彩色代表蛋白相互作用的第一层关系，白色则为第二层关系，颜色越深则代表靶点在药物、疾病作用过程中越重要，接点中结构为蛋白的3D结构。从图中分析可得AKT1、HAS2、MAP2、CDH1、PRKCG、PLAT等靶点作用最为突出，预测可能作用靶点为：PSMA4、RFC2、PSMC4、TNFRSF1A、KEAP1。
图3 PPI蛋白作用网络结构图
2.4三果汤治疗糖尿病GO功能富集
使用Metascape数据库对进行GO功能富集（如图4），根据分析出的富集通路，选择富集的前20个绘制富集柱状图，由蓝色到红色-log10依次递减。GO功能富集分析从三个层面进行分析：细胞组分（CC）分析、分子功能（MF）分析和生物过程（BP）分析。从图中可知，从细胞组学层面分析，主要富集在膜筏、转录调节复合物、膜侧等；从分子功能层面分析，主要富集在蛋白质同二聚化活性、蛋白质结构域特异性结合、激酶结合等；从生物过程层面分析，主要富集在对激素的反应、对细胞因子的反应、对无机物的反应等。
图4 三果汤治疗糖尿病GO功能富集图
(A：GO-CC分析；B：GO-BP分析；C:GO-MF分析)
2.5三果汤治疗糖尿病KEGG通路富集分析
使用Metascape数据库对进行KEGG通路富集分析（图5），根据KEGG通路分析，三果汤治疗糖尿病的信号通路主要在癌症通路、脂质和动脉粥样硬化、MAPK信号通路、化学致癌-受体激活、以及在糖尿病并发症中的产生作用的AGE-RAGE信号通路。
图5 三果汤治疗糖尿病KEGG通路分析气泡图
2.6分子对接结果
根据三果汤有效成分筛选，选择鞣花酸（Ellagic acid）、没食子酸（Gallic acid）与KEGG通路分析通路靶点AKT1、HAS2、MAP2进行分子对接，结合能越小，有效成分和靶点结合的亲和力越大（表4）。通过结合能可以看出，鞣花酸对靶点HAS2亲和力最好，同时没食子酸对HAS2的结合能存在一定的亲和力。对于靶点AKT1、HAS2、MAP2，鞣花酸的亲和力明显大于没食子酸。
表4 有效成分与靶点结合能
图6 分子对接结果
（A为鞣花酸与AKT1对接结果；B为鞣花酸与HAS2对接结果；C为鞣花酸与MAP2对接结果；D为没食子酸与AKT1对接结果；E为没食子酸与HAS2对接结果；F为没食子酸与MAP2对接结果）
3.讨论
流行病学数据显示，2017年我国老年人20%以上为糖尿病患者，2020年增长至30%以上[[[] 张茜,王战建,周亚茹,高怀林.2022版《中国老年2型糖尿病防治临床指南》专家解读[J].疑难病杂志,2022,21(05):445-449.]]。随着糖尿病患病人群逐渐增加，针对其病症的治疗方式逐渐增多。藏药中三果汤对糖尿病的治疗存在良好的治疗作用，具有降低空腹血糖、影响胰岛细胞凋亡等作用[[[] 方山丹. 藏药三果汤影响糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡及增殖的研究[D].云南中医药大学,2019.]]。藏药三果汤由余甘子、毛诃子、诃子组成。余甘子中主要成分没食子酸可能升高葡萄糖转运酶载体（GLUT-2）和PPARγ的表达，发挥降血糖的药理作用[[[] 李明玺,黄卫锋,姚亮亮,万春鹏.余甘子提取物降血糖活性及其主要成分研究[J].现代食品科技,2017,33(09):96-101.]]。诃子中有效成分诃黎勒酸能够降低大鼠进食后的血糖水平[[[] 李斌,李鑫,范源.诃子药理作用研究进展[J].药学研究,2015,34(10):591-595+603.]]。本文对藏药三果汤治疗糖尿病作用机制初步探讨，以为相关实验研究提供参考依据。
通过TCMSP等数据库对藏药三果汤进行有效成分分析及筛选，并对糖尿病疾病靶点进行分析，三果汤和糖尿病的共同基因蛋白靶点有269个，其中AKT1、HAS2、MAP2、CDH1、PRKCG、PLAT等靶点作用最为突出，并预测PSMA4、RFC2、PSMC4、TNFRSF1A、KEAP1存在可能为作用的新靶点。对三果汤的研究中，作用成分最为突出的鞣花酸和没食子酸与作用靶点最为突出的AKT1、HAS2、MAP2进行分子对接，鞣花酸对HAS2的结合能为-5.45，存在较好的亲和力，且从对接图中也可看出构象较稳定，说明鞣花酸对糖尿病受体蛋白结合稳定，存在治疗作用。
综上所述，三果汤具有多成分、多靶点的作用特点，对糖尿病起到治疗效果，为后续三果汤治疗糖尿病的相关机制研究提供新思路。且在本研究分析过程中发现，三果汤对癌症治疗存在可能性，为后续癌症治疗研究提供参考。本次实验结果基于数据库及文献进行分析，结果仅供参考，三果汤治疗糖尿病作用机制复杂，具体机制需进一步相关药理实验验证。
[1] Rajan SS, Antony S. Hypoglycemic effect of triphala on selected non insulin dependent Diabetes mellitus subjects. Anc Sci Life. 2008 Jan;27(3):45-9.
[2] Kamali SH, Khalaj AR, Hasani-Ranjbar S, Esfehani MM, Kamalinejad M, Soheil O, Kamali SA. Efficacy of 'Itrifal Saghir', a combination of three medicinal plants in the treatment of obesity; A randomized controlled trial. Daru. 2012 Sep 10;20(1):33.
[3] 张艳娇. 藏药三果汤通过胰岛旁分泌调节β细胞功能的实验研究[D].云南中医药大学,2021.
[4] Suryavanshi SV, Garud MS, Barve K, Addepalli V, Utpat SV, Kulkarni YA. Triphala Ameliorates Nephropathy via Inhibition of TGF-β1 and Oxidative Stress in Diabetic Rats. Pharmacology. 2020;105(11-12):681-691.
[5] Sahragard A, Alavi Z, Abolhassanzadeh Z, Moein M, Mohammadi-Bardbori A, Omidi M, Zarshenas MM. Assessment of the Cytotoxic Activity of Triphala: A Semisolid Traditional Formulation on HepG Cancer Cell Line. Biomed Res Int. 2021 Aug 11;2021:6689568.
[6] 李梢.网络靶标:中药方剂网络药理学研究的一个切入点[J].中国中药杂志,2011,36(15):2017-2020.
[7] 首个《网络药理学评价方法指南》发布[J].中医杂志,2021,62(09):776.
[8] 陈健,陈启龙.网络药理学在中医药研究中的现状及思考[J].上海中医药大学学报，2021,35(05):1-6+13.
[9] 张茜,王战建,周亚茹,高怀林.2022版《中国老年2型糖尿病防治临床指南》专家解读[J].疑难病杂志,2022,21(05):445-449.
[10] 方山丹. 藏药三果汤影响糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡及增殖的研究[D].云南中医药大学,2019.
[11] 李明玺,黄卫锋,姚亮亮,万春鹏.余甘子提取物降血糖活性及其主要成分研究[J].现代食品科技,2017,33(09):96-101.
[12] 李斌,李鑫,范源.诃子药理作用研究进展[J].药学研究,2015,34(10):591-595+603.