侯卫1 杜时雨1 汤小虎1,2*
(1.云南中医药大学 云南 昆明 650500;2.云南中医药大学第一附属医院 云南昆明 650032)
摘要：目的 挖掘中医药治疗痰瘀痹阻型类风湿关节炎的组方用药规律，并探讨高频药物组合的作用机制。方法 检索中国知网近20年治疗痰瘀痹阻型类风湿关节炎的方剂，利用古今医案云平台进行数据总结和分析，并利用TCMSP、STRING等数据库，Cytoscape软件、R软件等构建核心药对活性成分-靶点-疾病网络，对靶点基因进行信号通路的分析。结果 本研究共纳入173篇文献，共193张处方，涉及411味中药，当归、红花、川芎、桃仁等是用药频次最多的药物，温性药、辛味药在四气五味中占比最多，以归肝经药物出现频次最多，基于关联规则分析得出的高频中药组合为川芎-当归。网络药理学研究得到川芎-当归治疗类风湿关节炎的潜在作用靶标共35个，主要有β-谷甾醇、杨梅酮、豆甾醇等活性成分，蛋白互作分析中药治疗类风湿关节炎的关键蛋白可能是CASP3、PTGS2、ESR1等，KEGG富集分析主要在脂质与动脉粥样硬化、p53、IL-17等信号通路上。结论 中药治疗痰瘀痹阻型类风湿关节炎重在活血通经、散瘀行气止痛等方法，同时兼顾祛风散寒除湿，其机制可能通过作用PTGS2、ESR1等靶点及调控p53、IL-17等通路，发挥抗炎、免疫调节等相关。
关键词：类风湿关节炎；数据挖掘；川芎；当归；网络药理学[基金项目：国家自然科学基金项目(81960863)；重大疑难疾病中西医临床协作试点项目（国中医药办医政发[2018]3号）;云南省“高层次人才培养支持计划”“名医”专项，（YNER-MY-2018-045）;云南中医药大学第一临床医学院科学研究基金项目（2021Y04）;
Analysis of medication regularity and Mechanism of Rheumatoid Arthritis
With phlegm and static blood stagnancy syndrome based on data Mining and Network Pharmacology
HOU Wei1,DU Shi-yu1, TANG Xiao-hu1,2*
(1.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming,650500,China;2.The First Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming,650032,China;)
ABSTRACT Objective To explore the rule use in the treatment of Rheumatoid Arthritis with phlegm and static blood stagnancy syndrome based on data mining, to explore the mechanism of high-frequency drug combination.Methods Search CNKI prescriptions for treating phlegm and static blood stagnancy syndrome rheumatoid arthritis in recent 20 years,and use ancient and modern medical case cloud platform to summarize and analyze data,Use TCMSP、STRINGand other databases,Cytoscape software、R software constructed the core drug pair active component-target-disease network,then analysis of target genes signaling pathways.Results A total of 173 literatures and 193 prescriptions were included in this study, involving 411 traditional Chinese medicines, Angelica、safflower、chuanxiong and semen persicae were the most frequently used drugs,Among the four properties and five tastes, warm medicine and spicy medicine accounted for the largest proportion, and belong to liver channel medicine appeared the most frequently. The high frequency Chinese medicine combination obtained based on association rule analysis was Chuanxiong - Angelica sinensis. A total of 35 potential targets for the treatment of rheumatoid arthritis were obtained by network pharmacology study, including β-sitosterol, myricetin, stigmasterol and other active components.Protein interaction analysis the key proteins of TCM in the treatment of rheumatoid arthritis may be CASP3、PTGS2、ESR1、etc. KEGG enrichment analysis mainly focused on lipid and atherosclerosis, p53, IL-17 and other signaling pathways.Conclusion In the treatment of rheumatoid arthritis with phlegm-stasis obstruction, TCM mainly focuses on invigorate the circulation of menstruation, regulating qi and relieving pain, and simultaneously dispelling wind, dispersing cold and dehumidifying.Its mechanism may be related to anti-inflammatory and immune regulation by acting on targets such as PTGS2 and ESR1 and regulating p53 and IL-17.
Keywords：Rheumatoid Arthritis；data mining; Angelica;Chuanxiong ;network pharmacology
类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是见的自身免疫性疾病，主要临床表现是对称性多关节炎，病变关节表现为肿胀、疼痛、僵硬等，最终导致关节畸形和工作障碍等，并可伴有关节外多脏器的损害[1]。我国RA发病率在0.3%～0.6%[2]，可发生于任何年龄，女性发病率是男性2-3倍[3]。RA临床常用改善病情抗风湿药、非甾体抗炎药、生物制剂等，但需长期规范用药，尚缺乏根治及预防本病的有效措施。
亘古通今，众多中医学家致力于RA诊治，中医药在治疗和改善症状等方面疗效显著且毒副作用小，目前已成为较为系统的理论、体系。现代研究已经证实RA患者中晚期常出现关节畸形、类风湿结节及合并动脉粥样硬化、血管炎等，这些与痰瘀瘀阻密切相关，仅采用传统抗风湿药、生物制剂等控制RA病情的发展，需长期用药、易致患者依从性减低、自行停药、减药比例明显提高，因此中医药在中晚期RA患者的诊治中作用日益增长。本研究通过搜集近20年中医药治疗痰瘀痹阻型RA的相关医案、文献，并运用数据挖掘技术归纳、总结RA痰瘀痹阻证的用药规律及对药物组合的潜在作用机制进行探索，为RA的防治提供参考依据。
1 资料与方法
1.1检索方法
以“类风湿关节炎”“尪痹”“痰瘀痹阻”“中药”等为检索词，检索国家知识基础设施数据库（简称中国知网，CNKI）中收录的文献，时间为2000年1月至2020年12月。
1.2纳入标准
①中医诊断为“尪痹-痰瘀痹阻证”，西医诊断为“类风湿关节炎”，医案记录完整；②病例采用中医药治疗，可联合其他中西医治疗方法，包括病案分析、临床疗效观察、专家经验方等。③方剂名称、中药名称、用药剂量明确完整。
符合以上3条者，即可纳入本研究。
1.3排除标准
①病例诊断不明确，病例重复者（仅纳入时间早者）；②中药剂量缺失、方剂重复及组成不完成整者；③综述类文献；④动物实验。
有上述任意一项者，不纳入研究。
1.4 中药规范
为避免处方中以别名、采集、炮制、地区差异等不同，造成药物分析偏差，参照《中药学》[4]、《中华人民共和国药典》[5]对药物名称统一规范化，例炙细辛统一为细辛，生地统一为生地黄，元参统一为玄参，生甘草、炙甘草统一规范为甘草等。
1.5 数据分析与处理
将筛选符合纳入标准的医案录入古今医案云平台（V 1.5.7）中医案采集模块，该软件的算法经实践证实具有科学性、可靠性。录入过程由两位研究者共同完成，并对数据进行核查，以确保录入数据准确可靠。
1.6作用机制分析
将上述得到的核心药对输入中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索化学成分及作用靶点，检索条件“口服生物利用度≥30%且类药性≥0.18”，得到有效成分与作用靶点，并对靶点以Uniport数据库(https://www.uniprot.org)进行标准化，筛选条件:口服生物利用度（OB）＞30%、类药性（DL）＞0.18；在GeneCards数据库以“Rheumatoid arthritis”为检索词，获得RA的作用靶点，取RA和药对的交集靶点输入STRING数据库，绘制蛋白互作PPI网络图，利用 Cytoscape3.6.0软件构建核心药对-活性成分-靶点-RA网络及筛选核心化合物，对共同靶点进行KEGG通路富集分析。
2结果
2.1 基于数据挖掘的文献研究结果
2.1.1药物频次统计
本研究共纳入173篇文献，193张处方，涉及药味411味药，总频次2594次。其中使用频次以当归109次，红花88次，川芎86次，桃仁80次，白芥子73次排名较前，又以当归的使用频次最高，频率约为56.48％。使用频次前10的药物见表1。
表1 高频中药统计表
Table 1 Statistics of high-frequency Traditional Chinese medicine
2.1.2药物功效统计
中药的药物功效进行统计，结果以祛风湿、润肠通便、调经止痛、祛风止痛类排名较前。排名前10的见表2。
表2 中药功效统计表（排名前10）
Table 2 Statistical table of TCM efficacy (Top 10)
2.1.3药物药性药味统计
对纳入的411味中药进行四气统计，结果显示温性药使用最多，药用频次292次，频率为33.42%，其次为平、寒，具体结果见图1；五味统计以辛味药使用最多，药用频次1074次，频率41.40%，其次为苦、甘、咸，具体见图2。
2.1.4药物归经统计
对纳入的中药归经进行数据统计分析。在411味中药里，共出现5074次归经。结果为肝经(1440次，55.51%)，脾经(908次，35.00%)，心经(633次，24.40%)排名较前，具体见图3。
图3 药物归经统计图
Figure 3 Statistical chart of drug regression
2.1.5高频药物聚类分析
对193首中药处方中频次≥30的高频药物进行聚类分析，距离类型为欧式距离，聚类方法为最长距离法，聚类分析结果见图4。以距离＞9进行分组，可将药物分为5组。第1组：地龙、甘草；第2组：红花、桃仁、当归、川芎；第3组：白芥子、全蝎、僵蚕；第4组：威灵仙、桂枝。第5组：白芍、茯苓、陈皮、半夏、黄芪、鸡血藤、青风藤、羌活、牛膝、秦艽、没药。
图4 中药聚类分析图
Figure 4 Clustering analysis of Traditional Chinese medicine
2.1.6高频中药关联分析
运用古今医案云平台的数据挖掘中“关联分析”模块，以置信度＞0.6，支持度＞0.3，提升度＞1.4为条件，对高频中药进行分析，按照支持度高低进行排序，具体见表3。并根据支持度、提升度得到核心药对:川芎-当归。
表3 高频药物关联规则分析
Table 3 Analysis of high-frequency drug association rules
2.2 核心药物组合“川芎-当归”抗类风湿关节炎的作用机制分析
2.2.1川芎-当归的活性成分及对应靶标
从TCMSP中共获取当归的化学成分125种，川芎的化学成分189种。筛选出当归的活性成分2种，川芎的活性成分7种，见表4。同时，在数据库中获取川芎-当归活性成分的对应候选靶标共91个。
表4 川芎-当归的活性成分
Table 4 Active ingredients of Ligusticum chuanxiong - AngelicaID Name OB（%） DL Source
2.2.2川芎-当归的活性成分治疗RA的潜在作用靶标预测
在Uniprots数据库中输入靶标名称，获得91个候选靶标的相应基因。将其与GeneCards数据库检索到与RA疾病有关的靶基因相映射，用韦恩图筛选出川芎-当归治疗RA的潜在作用靶标共35个。并导入Cytoscape软件构建药物-成分-靶点-疾病网络图，并给予可视化展示见图5。根据网络Degree值结果，位居前三的成分依次为β-谷甾醇（beta-sitosterol）、杨梅酮(Myricanone)、豆甾醇（Stigmasterol）等，表明这些化合物是川芎-当归治疗RA的主要活性成分。
图5川芎-当归的关键活性成分与疾病靶标的网络
FIG 5 Network of key active components of Ligusticum chuanxiong -Angelica sinensis and disease targets
2.2.3 川芎-当归治疗类风湿关节炎靶点蛋白互作分析
将得到的35个共同靶点基因导入STRING数据库构建PPI网络，并利用R软件选取degree排名前20的靶点绘制条形图，见图6，图中条形柱的长度代表degree的大小，由图可CASP3、PTGS2、ESR1、JUN等基因排名较前。
图6 川芎-当归治疗RA可能的关键基因
Figure 6 Possible key genes of Ligusticum chuanxiong - Angelica in RA treatment
2.2.4 KEGG功能富集分析
通过KEGG分析结果显示共有96条KEGG代谢通路参与其中，筛选出富集基因数较多的前20条通路，主要涉及脂质与动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、p53号信号通路（p53 signaling pathway）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、Apoptosis - multiple species（细胞凋亡-多物种）、AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）等。见图7。
图7 川芎-当归治疗RA潜在作用靶标的GO富集分析
Figure 7 GO enrichment analysis of potential targets of Ligusticum chuanxiong-Angelica for RA treatment
3 讨论
查阅古书典籍中并无“类风湿关节炎”这一病名，根据症状将其归为“痹证”“尪痹”等范畴，认为其“正虚”为内在因素，“邪侵”为外在因素。疾病后期往往出现“痰浊”“瘀血”等有形之邪搏结关节，正如《医级》所云：“痹非三气，患在痰瘀。”临床应该加以重视。张金山[6]等人研究发现痰瘀痹阻证RA较其它证型病程偏长，且疾病活动和关节病变数目显著升高。痰瘀痹阻证RA患者的RF、抗CCP等实验室指标阳性率高于其它证型且骨破坏情况较严重[7]。将古今医案云平台数据挖掘和网络药理学研究方法相结合，深入研究痰瘀痹阻证RA的用药规律及作用机制，为临床RA的治疗提供参考。
本研究以RA痰瘀痹阻证为研究对象，通过搜集近20年的173篇相关文献，193个处方，录入古今医案云平台进行数据挖掘、分析，总结出痰瘀痹阻型RA的用药规律。药物使用频率统计得出，具有活血通经、散瘀止痛之效的红花出现频率最高，红花富含红花黄色素、红花红色素、红花多糖等多种化合成分，具有抗炎、调节免疫、抗缺氧、调节血液形态等多种作用[8]。川芎出现频率仅次于红花，其有活血行气、祛瘀止痛、祛风等功效，如《日华子本草》所言“治一切风，一切气，一切劳损，一切血，补五劳，壮筋骨”。其主要成分为生物碱、多糖类等，具有抗炎、镇痛、抗氧化等功效[9]。药物的归经主要为祛风湿药，本质为祛除风寒湿邪，治疗风湿痹病，现代研究证实祛风湿药对细胞免疫、自然杀伤细胞及非特性免疫功能等均具有抑制作用，从而发挥抗炎、镇痛、免疫抑制等作用[10]。药物归经频率以肝经、脾经为主。
肝主疏泄，维持气机疏通畅达，保障机体“通而不滞、散而不瘀”，肝气瘀滞，则影响血运受阻，不通则痛，可见肢体筋骨、肌肉疼痛等症状；肝血亏虚，筋骨失濡，可见肢体疼痛、屈伸受限。代雪双[11]等研究发现《中华医典》中“痹证”“尪痹”用药规律中，归肝经药物最多，并且治疗RA应从肝论治，以疏肝解郁法为主。RA患病日久、痰瘀痹阻，加之长期服药可影响脾胃功能，临证更应注重顾护脾胃[12]。在关联分析中，组合支持度、提升度排名前3依次为“川芎-当归”“桃仁-红花”“红花-当归”，以上药物组合大多为活血通络、化痰行瘀、祛风止痛等功效，与痰瘀痹阻证RA的病因病机相符合。川芎-当归早在《太平惠民和剂局方》中就有详细记录，广泛存在于四物汤、独活寄生汤、当归四逆散、补阳还五汤等方药中，芎归配伍可以增强活血止痛、祛瘀通络等功效。川芎与当归共有的有效成分为阿魏酸、绿原酸、藁本内酯等，对免疫功能有良好的调节作用。相关研究证实两者1∶1配伍是抗炎、镇痛作用最强[13]。
从网络药理学分析结果，发现β-谷甾醇（beta-sitosterol）、杨梅酮(Myricanone)、豆甾醇（Stigmasterol）的Degree值位列前三，说明它们可能是治疗RA的关节活性成分。β-谷甾醇和豆甾醇同为植物甾醇，具有抗炎症、免疫调节等多种生物活性。有研究发现β-谷甾醇可将M1极化骨髓源性巨噬细胞中IL-1β、CD86等分子表达降低，M2中IL-10、CD163等分子表达增加，使M1/M2平衡恢复，减缓类风湿性炎症表现[14]。杨梅酮的抗炎作用可以与抑制IL-1、IL-6、IL-4等多种炎症细胞因子的表达相关[15]。通过PPI网络分析发现，川芎-当归防治RA的核心Hub基因前三的依次为CASP3、PTGS2、ESR1。滑膜细胞的过度增生、活化和凋亡不及可导致RA的软骨与骨组织的损伤，而诱导CASP3活化可促进滑膜细胞凋亡、抑制增生，减轻关节RA症状[16]。PTGS2是前列腺素生物合成的关键酶，对细胞的作用主要体现在保护方面，改善疾病的炎症反应主要体现在调节PTGS2靶点的水平[17]。ESR1依赖ERK信号通路调控细胞的增殖、自噬和凋亡，促进软骨发育[18]，还可调控免疫反应及炎症细胞因子表达[19]。通过KEGG通路富集分析结果，显示药物活性成分主要通过炎症等相关通路发挥调节RA的作用。相关研究表明，“痰瘀互结”是RA与动脉粥样硬化共病机，痰瘀痹阻证RA患者合并动脉粥样硬化较其它证型较多[20,21]，炎症反应加速斑块不稳定化，同时可以加重炎症反应。张婷[22]研究发现抑制P53可促进炎症细胞因子分泌增加，引起滑膜成纤维细胞分泌增加，导致滑膜炎症和关节破坏。IL-17信号通路在RA病理过程中发挥中药作用，IL-17为促炎性细胞因子，诱导炎症因子、趋化因子等，进而激活NF-κB通路，促进RA滑膜炎性反应，导致关节损伤[23]。
综上所述，本研究基于辨证为痰瘀痹阻型RA的基础上进行文献汇总，分析临床痰瘀痹阻型RA的用药规律，并对核心药物组合川芎-当归进行网络药理学的研究，初步探讨可能的作用靶点、通路等。将数据挖掘与网络药理学的研究方法结合，为中医药治疗RA提供参考。但研究结果与实验研究等仍存在一定差距，应予进一步的研究，为RA提供更精准的治疗方向。
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