温阳散寒除湿法对类风湿关节炎Th17/Treg细胞平衡调控作用及机制的研究(2)

　　2.3.3 流式细胞术（FACs）检测

　　对胞内细胞因子染色：各组1×106个小鼠脾淋巴细胞与PMA、Ionomycin以及BFA于5%CO2培养箱中共培养4h后，收集细胞，冼液冼2次，加入IgG抗体，封闭FcR，进行表面标志CD4染色。完毕后，固定、穿膜，加入荧光标记的抗IL-17抗体，流式细胞仪检测分析。对于Treg细胞的检测，无需上述刺激，按胞内细胞因子染色检测，Flowjo软件分析。

　　2.3.4 蠲痹颗粒醇提物对CD4+T细胞细胞因子产生作用

　　CD4+ T淋巴细胞（4×105个/孔）接种于anti-CD3 mAb（5mg/ml）包被的24孔培养板中，同时加入不同浓度的蠲痹颗粒提取物。细胞于含5%CO2培养箱中培养36h，收集培养上清，酶联免疫吸附法（ELISA）法检测上清中IL-10、IL-6、IFN-g和L-17A的水平。

　　2.3.5 荧光定量PCR检测Th17细胞相关基因的表达

　　抽提1×107个小鼠脾淋巴细胞，应用Trizol试剂盒提取总RNA，按Takara逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA。尔后应用SYBR GreenI嵌合荧光法在实时定量PCR仪进行Th17细胞相关基因（IL-17A、IL-17F、IL-21、 IL-23p19和RORgt）表达检测，相关引物由上海生物工程有限公司合成公司合成。在PCR反应程序结束后，进入仪器自带软件的数据分析界面，设置β-actin为内参基因，仪器自动计算出各实验组基因表达差异倍数及标准差，即2-△△Ct±标准差值。特异基因引物系列如下：

　　2.3. 6蠲痹颗粒醇提物对CD4+T细胞MAPK信号通路的影响

　　PBS稀释的anti-CD3 mAb （5mg/ml） 加入24孔培养板，于4℃包被过夜 ，用PBS洗两次。加入CD4+ T淋巴细胞 （5×106个/孔）、anti-CD28 mAb（2mg/ml） 和不同浓度的蠲痹颗粒提取物，刺激作用30min，另设无刺激剂对照组。收集细胞于Eppendorf管中，裂解细胞，BCA蛋白定量试剂调成统一浓度后， 100℃水浴煮沸5-10min，提取总蛋白。垂直电泳分离、转膜、封闭，分别加入抗p-ERK、p-JNK、p-P38和总的ERK、P-38，4℃过夜，加入相应的二抗，曝光、定影、拍照。

　　2.4. 统计分析

　　所有实验数据均采用统计学方法处理。均值间差异比较采用t检验或单因素方差分析，数据统计均以平均值±标准差表示，以P﹤0.05为显著水平。数据统计分析采用SPSS17.0统计软件包。

　　3、实验结果

　　3.1 蠲痹颗粒醇提物对正常小鼠脾淋巴细胞增殖功能的影响。

　　图 1.A 结果显示，丝裂原ConA能够显著诱导正常小鼠T淋巴细胞增殖活性，蠲痹颗粒醇提物30mg/ml药物干预后，能够显著抑制ConA诱导正常小鼠T淋巴细胞增殖作用，经统计学处理，差异有显著性意义（P<0.01）；图1.B结果表明，蠲痹颗粒醇提物30mg/ml显著抑制anti-CD3 mAb诱导正常小鼠脾脏T淋巴细胞活化，差异有显著性意义（P<0.01）。丝裂原细菌脂多糖（LPS）显著刺激正常小鼠B淋巴细胞增殖活性，蠲痹颗粒醇提物30mg/ml药物干预显著抑制正常小鼠B淋巴细胞的增殖活性，差异有（P<0.01），结果见图1.C。结果见图1.显示，蠲痹颗粒醇提物在浓度3-30mg/ml对正常脾淋巴细胞活度无明显的影响（P>0.05），提示蠲痹颗粒醇提物在3-30mg/ml对正常小鼠淋巴细胞无细胞毒性作用。上述结果提示，蠲痹颗粒醇提物具有显著的免疫抑制活性，在防治类风湿关节炎具有较好的应用前景。

　　图 1. 蠲痹颗粒醇提物对正常小鼠脾淋巴细胞增殖功能的影响。正常小鼠脾淋巴细胞，与不同浓度的蠲痹颗粒醇提物在丝裂原（ConA 或LPS）或anti-CD3 mAb刺激下共培养48 h ， MTT法检测淋巴细胞的增殖活性。A.蠲痹颗粒醇提物对ConA诱导的T淋巴细胞增殖功能的影响;B.蠲痹颗粒醇提物对LPS诱导的B淋巴细胞增殖功能的影响.C. 蠲痹颗粒醇提物对anti-CD3 mAb诱导T淋巴细胞增殖作用的影响。D. 蠲痹颗粒醇提物对正常小鼠脾淋巴细胞细胞毒性作用（MTT法）；结果以mean±SD.表示。*P<0.05，**P<0.01，对照组vs蠲痹颗粒醇提物干预组。