β-PGG对高糖状态下INS-1细胞凋亡的保护作用(3)

　　3、改良MTT法测定β-PGG对INS-1细胞活性的影响

　　(1) 将备用的INS-1细胞悬液接种于96孔板，90μL/孔。

　　(2) 顺序加入10μL的受试药品，受试药品为β-PGG。阴性对照为等体积的N.S，各加药组及对照组均设3个平行孔，每块板设3个调零孔(只加RPMI1640完全培养基)。受试样品的终浓度为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L；

　　(3) 将细胞置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养48h。

　　(4) 向培养板中分别加入10μL/孔的MTT液（5mg/ml），置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养4h。

　　(5) 向培养板中分别加入100μL/孔三联液[10%SDS-5%异丁醇-0.012ml/LHCL(w/v/v)] ，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养12h。

　　(6) 将培养板置于酶标仪中，于570nm、63Onm双波长下测定各孔的（OpticalDensity, OD）值。

　　(7) 结果处理：计算各个受试样品不同测试浓度OD值得均数及标准差，并用以公式计算细胞存活率：

　　细胞存活率=(OD样品-OD空白)/(OD阴性对照-OD空白)××100%

　　4、流式细胞仪检测β-PGG对高糖状态下INS-1细胞凋亡的影响

　　（1）取对数生长期的INS-1细胞，胰蛋白酶消化，收集并离心细胞，用含10%胎牛血清的RPMl1640完全培养液配成浓度为1×105个/ml的细胞悬液，将细胞种入6孔板中，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24h。

　　（2）培养24h后，分别给予对照组、高糖模型组、β-PGG药物组处理，并置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养48h。

　　（3）用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，值得注意的是胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性。

　　（4）用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集1-5×105个细胞。

　　（5）加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞。

　　（6）加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL Propidium lodide,混匀。

　　（7）室温、避光、反应5-15min。

　　（8）并在1hour 内，进行流式细胞仪的检测。

　　5、统计学处理

　　实验所得的数据用Spss 17.0软件进行统计学分析，各组实验数据均以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVE）、方差齐时采用LSD法检验，方差不齐时者采用Tamhane’T检验，检验水准α=0.05，P<0.05有统计学意义。